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CRISPR/Cas9

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Edição de genomas através do sistema CRISPR/Cas9

A descoberta recente do sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) em procariotos, originalmente descoberto na bactéria Streptococcus pyogenes, tem revolucionado o campo de biologia molecular e engenharia genética. O sistema CRISPR funciona como um mecanismo natural de defesa contra vírus e DNA exógeno em bactérias e foi remodelado por pesquisadores para edição gênica altamente eficiente em sítios direcionados no genoma desejado.

O sistema utiliza uma nuclease associada ao CRISPR (Cas9) que forma um complexo com pequenos RNAs guias (gRNAs) para clivagem do DNA em uma sequência específica logo após o um motivo chamado PAM (protospacer adaptor motif), em qualquer localização genômica homóloga ao gRNA. O sistema CRISPR/Cas9 é formado por RNAs guias independentes conhecidos como crRNA e tracrRNA. Na tecnologia atualmente utilizada na pesquisa biomédica, esses dois RNAs foram combinados em um único RNA que permite um corte sítio-específico no genoma de mamífero através do design de um gRNA específico para o gene alvo.

Veja abaixo um esquema das sequências envolvidas na clivagem do DNA pela nuclease Cas9:

Através da nuclease Cas9 nativa ou com atividade de nickase, é possível clivar o DNA alvo na sequência desejada, tanto clivagem da dupla-fita quanto apenas uma das fitas (nick) do alvo.

Através de diferentes mecanismos de reparo do DNA celular a sequência alvo será editada e reparada por via recombinação homóloga (HR, homologous recombination) ou não-homóloga (NHEJ, nonhomologous end joining).

Por exemplo, no caso de uma inserção knock-in no genoma hospedeiro, um vetor de recombinação homóloga que contenha uma sequência para susbtituição no genoma deve ser utilizado.

A Cas9 clivará a fita de DNA no alvo escolhido e o reparo celular via recombinação homóloga permitirá a incorporação da sequência do vetor de recombinação homóloga na posição desejada do genoma.

Veja abaixo algumas das possibilidades que o sistema CRISPR/Cas9 oferece:

A Uniscience oferece diferentes reagentes e plasmídeos para utilização desta metodologia em seu laboratório, além dos serviços customizados para planejamento de experimentos, clonagem de vetores e células recombinantes customizadas.
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