A descoberta recente do complexo CRISPR/Cas9 forneceu aos pesquisadores uma valiosa ferramenta para direcionar e modificar qualquer sequência genômica com alta especificidade e eficácia. O sistema consiste em uma nuclease guiada por RNAs (Cas9) e um RNA guia (gRNA) complementar à sequência alvo. Esse sistema permite a clivagem da sequência alvo no genoma e permite realização de inserções, deleções ou mutações na região selecionada.

PrecisionX™ Cas9 SmartNuclease permite utilização do sistema CRISPR/Cas9 de maneira extremamente prática e eficiente

A SBI oferece:

• Notas de aplicações detalhadas para knock-in, knock-out e edição do genoma
• Design de gRNA e vetores de recombinação homóloga (HR Donor Vector)
• Serviços customizados de engenharia genômica – Cloning & Recombinant Cell Line
• Validação de aplicações in vitro e in vivo utilizando o sistema SmartNuclease

Worflow básico de um protocolo de edição gênica utilizando Cas9

– DESIGN: planejamento dos gRNAs para o gene alvo e plasmídeo de expressão da Cas9 a ser utilizado para knock-in, knock-out ou tagging. O uso de vetor de recombinação homóloga é altamente recomendado pois aumenta consideravelmente a eficiência da edição gênica.

– CLONAGEM: ligação do gRNA ao vetor contendo Cas9 (Cas9 All-in-one vector) ou vetor específico para gRNAs. Realização da clonagem das sequências homólogas ao gene alvo no vetor de recombinação homóloga e, no caso de knock-in, a sequência de DNA para substituição.

– CO-TRANSFECÇÃO ou CO-INJEÇÃO: introdução da Cas9, gRNAs e sequência de recombinação homóloga nas células alvo utilizando reagentes para transfecção de plasmídeos, transdução lenti/adenoviral ou co-injeção de mRNAs.

– SELEÇÃO: seleção das células mutadas de acordo com o método desejado (seleção por antibióticos, fluorescência ou outros).

– VALIDAÇÃO: realização de PCR e/ou sequenciamento para confirmação da edição gênica no genoma celular (em um ou ambos alelos).

Guias de aplicações usando CRISPR/Cas9

Especialistas em engenharia genômica da SBI desenvolveram protocolos detalhados para novos usuários do sistema CRISPR/Cas9, descrevendo detalhes do design do gRNA e HR Donor Vector para as seguintes aplicações:

• CRISPR/Cas9 Gene Knock-Out Application Note (PDF) »
• CRISPR/Cas9 Gene Editing Application Note (PDF) »
• CRISPR/Cas9 Gene Tagging Application Note (PDF) »

Serviços customizados de clonagem e geração de linhagens celulares recombinantes

A SBI também oferece serviços customizados para design e clonagem de gRNA e HR donor vector para qualquer projeto de engenharia genômica. Além disso, está disponível o serviço de geração de linhagens celulares recombinantes para knock-in, knock-out e mutação em diversas linhagens celulares comercialmente disponíveis.

Sistema altamente eficiente já validado por diversos pesquisadores

A SBI foi a primeira empresa comercial a oferecer as ferramentas CRISPR/Cas9 para pesquisa, iniciando em abril de 2013. Atualmente diversos pesquisadores já produziram excelentes resultados utilizando os reagentes da SBI em seu laboratório, tanto em aplicações in vitro quanto in vivo, com citações dos produtos nas publicações.

Como exemplo, uma taxa de eficiência de mutação de até 75% foi descrita recentemente na NIH utilizando o sistema Cas9 SmartNuclease da SBI para edição do genoma em zigotos de camundongo, com 90% destas sendo mutações homozigotas. Consulte o site da SBI para referências bibliográficas.

Verifique abaixo os produtos disponíveis ou consulte o site de nosso fornecedor clicando aqui.

O que são plasmídeos Cas9 SmartNuclease™ All-in-one?

Para tornar o sistema PrecisionX ainda mais eficiente e conveniente, a SBI desenvolveu os plasmídeos Cas9 All-in-one. Esses plasmídeos contém uma Cas9 otimizada para códons humanos (hspCas9) ou mutante Cas9 (Cas9 Nickase) juntamente com uma sequência customizada de RNA guia (gRNA) consistindo em transcrito quimera de crRNA-tracrRNA. Esses dois componentes essenciais para o funcionamento do sistema CRISPR são expressos através deste único plasmídeo tornando os protocolos mais simples e eficientes.

Além disso os plasmídeos Cas9 All-in-one contém marcadores de fluorescência (GFP ou RFP) para rastreamento da eficiência nas células alvo e utilizam o promotor T7 para transcrição in vitro de Cas9 e gRNAS para preparação de mRNAS necessária para algumas aplicações in vivo (e.g. microinjeção em oócitos).

O SBI desenvolveu um kit revolucionário para facilitar a clonagem de gRNAs em vetores CRISPR/Cas9, o kit de clonagem PrecisionX Multiplex gRNA (Cat # CAS9-GRNA-KIT). Este sistema permite a clonagem de vários gRNAs em qualquer vetor de expressão de Cas9/gRNA ou vetor de clonagem de gRNA escolhido pelo cliente, incluindo os plasmídeos e vetores para lentivírus da linha PrecisionX Cas9/gRNA SmartNuclease da SBI. O Multiplex gRNA Cloning Kit também é compatível com os vetores de clonagem Cas9/gRNA mais populares desenvolvidos em laboratórios em todo o mundo, como pX330, pX335, pX458 e pX459.

Produção de mRNA sintético e T7 gRNA de Cas9

Para tornar o sistema de edição gênica com Cas9 mais eficiente e conveniente para aplicações in vivo, a SBI desenvolveu o produto CRISPR/Cas9 mRNA, o qual inclui um mRNA Cas9 funcionalmente validado (cat# CAS500A-1), T7 gRNA cloning vector e kit para produção de gRNAs. Um gRNA (crRNA-tracrRNA chimeric transcript) pode ser criado a partir do vetor de clonagem T7 gRNA linearizado (pronto para uso, cat# CAS510A-1) através do uso de um oligo duplex anelado, codificando uma sequência alvo 20bp acima da PAM (5′-NGG-3′). Como o gRNA está sob o controle do promotor T7, ele também pode ser utilizado para transcrição n vitro utilizando o kit de síntese de T7 gRNA (cat# CAS510A-KIT).

A sequência AAVS1 gRNA foi clonada no vetor CAS510A-1 T7 e gRNAs tendo como alvo o sítio AAVS1 foram produzidos in vitro. Esses gRNAs foram co-transfectados com mRNA sintético Cas9 em combinação com o vetor de recombinação homóloga (HR AAVS1) portando o gene repórter GFP. A atividade da transfecção de Cas9 mRNA + AAVS1 gRNA foi comparada com a atividade do sistema EF1 Cas9 SmartNuclease-AAVS1 gRNA All-in-one. As imagens das células com fluorescência da GFP foram obtidas após 3 dias.

A SBI disponibiliza mRNA de Cas9 pronto para transfecção para utilização em sistema in vivo e in vitro procarioto e eucarioto.

Sistema lentiviral:

A SBI oferece vetores validados para transdução e expressão de Cas9/gRNAs utilizando o poderoso sistema de lentiviral (lentiviral vectors – LVVs). O sistema Lenti-Cas9 SmartNuclease é ideal para realizar edição gênica em células difíceis de transfectar com plasmídeos, células não-proliferativas e in vivo, aumentando a flexibilidade do sistema CRISPR/Cas9 para engenharia genética. Esse sistema também permite a geração de linhagens celulares recombinantes estáveis expressando a nuclease Cas9. Todos os vetores expressam uma Cas9 otimizada para códons humanos (hspCas9) ou mutante Cas9 (Cas9 Nickase) juntamente com uma sequência customizada de RNA guia (gRNA) consistindo em transcrito quimera de crRNA-tracrRNA. Os gRNAs são transcritos através dos promotores H1 ou U6, dependendo do tipo celular utilizado em sua pesquisa. Esse sistema permite edição de qualquer alvo no genoma in locus contendo uma sequência N20-NGG. Sequências de outros formatos (N17-18-NGG) podem ser utilizadas.

Há disponibilidade de partículas lentivirais com Cas9 SmartNuclease já prontas para uso?

Sim, a SBI também oferece partículas lentivirais pré-empacotadas prontas para utilização em cultura celular para expressão da nuclease Cas9 ou Cas9 Nickase. As partículas lentivirais são preparadas com alto controle de qualidade, acompanhadas de análise funcional da titulação e dados de transdução de cada lote de produção lentiviral.

Sistema adenoviral:

A SBI também oferece vetores validados para transdução e expressão de Cas9/gRNAs utilizando o poderoso sistema adenoviral (adeno-associated vectors – AAVs). O sistema AAV-Cas9 é ideal para realizar edição gênica em células difíceis de transformar com plasmídeos, células não-proliferativas e in vivo, aumentando a flexibilidade do sistema CRISPR/Cas9 para engenharia genética. Esse sistema também possibilita a geração de linhagens celulares recombinantes estáveis expressando a nuclease saCas9. O sistema AAV-Cas9 SmartNuclease é especialmente indicado para aplicações in vivo, já que não apresenta fenótipos patogênicos associados ao adenovírus.

– Edição de genoma pós-natal em animais
– Desenvolvimento de terapia gênica em pequenos animais
– Geração de novos modelas para estudos de doenças
– Disponível versão AAV-Cas9 All-in-one ou formato de dois vetores para expressão de Cas9/gRNAs.

Quais as principais diferenças entre o sistema utilizando LVVs (lentiviral vectors) e AAVs (adeno-associated vectors)?

Os sistemas LVV e AAV são métodos altamente eficientes para transdução de genes em modelos celulares in vitro e in vivo. Ambos são capazes de infectar células em estado proliferativo ou não-proliferativo. O sistema AAV não promove integração do gene no organismo do hospedeiro, permite expressão do gene transduzido por longos períodos e, por não ter efeitos patogênicos, é uma escolha segura para terapia gênica e engenharia genética em modelos animais (Vasileva A, 2005; Petrs-Silva H, 2013). Entretanto, AAVs têm capacidade de expressão de insertos menores de 5kb, enquanto LVVs têm capacidade de comportar sequências mais longas.

Dependendo do tipo celular utilizado, um sistema pode apresentar tropismo maior por alguns tipos celulares específicos. Recomendamos verificar na literatura qual sistema apresenta maior eficiência para o modelo de organismo que deseja utilizar em sua pesquisa.

A SBI oferece produtos para detecção de mRNA e proteína nuclease Cas9 para validação da transcrição/expressão da nuclease Cas9 em células nas quais a edição gênica foi realizada.

Os primers permitem detecção do mRNA da Cas9 através de RT-PCR, e tem como produto uma banda de 219pb ou 122pb dependendo do par de primers utilizado. Esses primers são compatíveis com todos os vetores contendo Cas9 comercializados pela SBI.

O anticorpo monoclonal anti-Cas9 produzido em camundongo permite a deteção das nucleases Cas9, Cas9 Nickase e Cas9 Null-mutant. Esse anticorpo é validado para utilização em diferentes metodologias:

• Western blot analysis: (1:500)
• Immunofluorescence: (1:500)
• Immunoprecipitation: 2µg/10^6 cells