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Uniscience 20-03-2017

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Amplificação Isotérmica – LAMP

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ENTENDENDO A AMPLIFICAÇÃO TÉRMICA MEDIADA POR LOOP

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica bem estabelecida para amplificar uma sequência específica de DNA . Além da PCR tradicional, rotineira nos laboratório de biologia molecular e diagnóstico molecular, existem outros métodos de amplificação de DNA. 

Essas abordagens alternativas geralmente não requerem variação da temperatura da reação e, portanto, são frequentemente chamadas de amplificação isotérmica. Os protocolos de amplificação isotérmica são diversos e têm vantagens variadas. Algumas dessas vantagens são: reações extremamente rápidas e a não utilização de termocicladores.

Quatro exemplos de tecnologias de amplificação isotérmica de DNA incluem:

Usa de 4-6 primers que reconhecem de 6-8 regiões distintas do DNA alvo. Uma DNA polimerase que inicia a síntese da fita complementar e 2 dos primers formam estruturas de alça para facilitar os ciclos subsequentes de amplificação. O LAMP é rápido, sensível e à amplificação é tão extensa que o pirofosfato de magnésio produzido durante a reação pode ser visto a olho, tornando o LAMP adequado para diagnósticos de campo.

Baseia-se em uma polimerase de DNA que desloca a cadeia, tipicamente Bst DNA Polymerase, Large Fragment ou Klenow Fragment (3′-5 ‘exo–), para iniciar em cortes criados por uma endonuclease de restrição limitada ou uma enzima de corte em um sitio contido em um primer. O local de corte é regenerado a cada passo de deslocamento da polimerase, resultando em amplificação exponencial. O SDA é normalmente usado em diagnósticos clínicos.

É emprega a uma helicase a atividade de desenrolamento da fita dupla DNA separando as fitas, permitindo o anelamento e a extensão do primer por uma DNA polimerase que inicia a síntese fita. Como a PCR, este sistema requer apenas dois primers . O HDA foi empregado em vários dispositivos de diagnóstico e testes aprovados pela FDA.

Emprega uma DNA polimerase de deslocamento de cadeia iniciada em um nick criado por uma enzima de nicking, produzindo rapidamente muitas sequências curtas de ácidos nucleicos a partir da sequência da alvo. Esse processo é extremamente rápido e sensível, permitindo a detecção de pequenas quantidades-alvo em minutos. O NEAR é comumente usado para detecção de patógenos em aplicações clínicas e de biossegurança.

FIGURA: Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) uses 4-6 primers recognizing 6-8 distinct regions of target DNA. A strand-displacing DNA polymerase initiates synthesis and 2 of the primers form loop structures to facilitate subsequent rounds of amplification.

WarmStart LAMP Kit

O WarmStart LAMP Kit foi projetado para fornecer uma etapa simples para amplificação por LAMP de alvos de DNA ou RNA. LAMP é um técnica de amplificação isotérmica comumente usada que fornece rápida (30 minutos) detecção de um ácido nucleico alvo usando primers (fornecido pelo usuário) e uma DNA polimerase. O master mix contém uma robusta e rápida DNA Bst 2.0 WarmStart Polimerase e WarmStart RTx Transcriptase Reversa, ambas em enzimas desenvolvidas, para melhorar o desempenho nas reações LAMP em uma solução tampão otimizada. O kit também inclui um corante fluorescente para permitir aferir a fluorescência em tempo real da LAMP. O master mix colorimétrico LAMP 2X da WarmStart (DNA e RNA) é semelhante ao master mix fornecido com o kit, mas contém um corante colorimétrico, permitindo a detecção visual de alteração da cor rosa claro para amarelo, que muda quando ocorre amplificação. Ao contrário de muitas outras técnicas de amplificação, este produto requer apenas um termo-bloco para que a reação ocorra.

Vantagens

• Formulação dupla WarmStart;
• Detecção rápida de alvos de DNA e RNA;
• Alta especificidade;
• Compatível com variedade de métodos de detecção (NEB # E1700);
• Detecção colorimétrica integrada (NEB # M1800).

As tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos são usadas nos campos da biologia, diagnóstico molecular e clínico e, cada vez mais, em outras aplicações como testes agrícolas e veterinários para a análise de pequenas quantidades de ácidos nucleicos. A técnica primária usada é a PCR, mas a PCR requer um instrumento capaz de termociclagem, o que limita a portabilidade, velocidade e facilidade de uso / custo. Uma série de fatores que levou ao surgimento de tecnologias isotérmicas de amplificação, como a amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) sendo a mais proeminente e amplamente utilizada. LAMP fornece resultados acessíveis, sensíveis, específicos, fáceis de usar, robustos e rápidos para o usuário final. O LAMP é usado para vários ensaios de diagnóstico aprovados pela FDA e forma a base de inúmeros testes em desenvolvimento.

WarmStart LAMP Kit é compatível com vários métodos de detecção:

Real-time fluorescence:
Adicionando o corante fluorescente LAMP ao 2X Master Mix permite a detecção em tempo real da amplificação LAMP em um instrumento de fluorescência em tempo real (por exemplo um equipamento de qPCR).
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Real-time and end-point turbidity:
A detecção do produto de amplificação pode ser determinada via turbidez que ocorre por uma quantidade crescente de precipitado de pirofosfato de magnésio em solução como subproduto da amplificação. A turbidez é medida por inspeção visual após conclusão da reação ou em tempo real usando um turbidímetro.

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Detecção visual: 
O precipitado de pirofosfato de magnésio permite fácil visualização por olho nu, especialmente para maiores volumes de reação. A reação pode ser seguida por fluorescência usando corantes intercalantes, SYBR ou brometo de etídio. Outros indicadores, como azul de hidroxinaftol, verde malaquita e calceína (não fornecido) podem ser usados para criar uma alteração visível da cor que pode ser vista a olho sem a necessidade de equipamentos caros, embora a mudança visível da cor não seja tão rápida ou sensível quanto detecção de fluorescência do produto NEB # M1800 (WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA).

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Eletroforese:
A análise por eletroforese é comumente usada para produtos de amplificação, e os produtos de LAMP podem ser detectados em géis de agarose, embora não seja recomendada.
 

WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix

Para detecção colorimétrica de fácil visibilidade, o WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix é o melhor da categoria para detecção visual de LAMP. Para clientes interessados em detecção visual, sala de aula, aplicações de campo / POC, este seria o produto recomendado.

Principais Recursos
• Enzimas projetadas e otimizadas para LAMP; 
• Formulação dupla WarmStart;
• Corante fluorescente separado fornecido com o kit (NEB # E1700);
• Utiliza Bst 2.0 WS e WS RTx;
• Detecção colorimétrica (NEB # M1800).

Benefícios
• Alta velocidade, sensibilidade e especificidade;
• Configuração da reação à temperatura ambiente;
• Compatível com vários métodos de detecção de LAMP (por exemplo, fluorescência, detecção visual, turbidez e eletroforese);
• Velocidade mais rápida RT-LAMP;
• A leitura visual simples não requer equipamento especial.

*Primers para LAMP não são fornecidos

Ferramenta recomendada para design de Primers LAMP:

PrimerExplorer: https://primerexplorer.jp

Diferenciais

O kit WarmStart LAMP da NEB (DNA e RNA) oferece detecção de alvo de RNA significativamente mais rápida e detecção equivalente de DNA quando comparado a outros produtos comercialmente disponíveis. Além disso, nossa exclusiva formulação WarmStart dupla que permite a configuração da reação em temperatura ambiente. Ao contrário de produtos similares que são limitados no formato de detecção, o kit da NEB é compatível com todas as detecções padrão de LAMP .

Por fim, o WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix fornece a melhor detecção visual da categoria para o LAMP, atraente para aqueles que podem querer executar testes de diagnóstico em áreas com recursos limitados.

Este produto não requer instrumentação extensa ou volumosa.

Figura 1. WarmStart do NEB
O kit LAMP (DNA e RNA) é compatível com vários métodos de detecção. O Kit inclui corante fluorescente separado para medição em tempo real da fluorescência. Como alternativa, a detecção pode ser realizada por detecção de turbidez ou visualização de terminal.

Aplicações

O LAMP é útil principalmente como uma técnica de diagnóstico ou detecção, e os usuários abrangem clientes OEM desenvolvendo ensaios de diagnóstico clínico para usuários acadêmicos que desejam uma detecção simples. LAMP tem o potencial para ser usado como um simples teste de triagem em campo ou no local de atendimento por médicos.
Como o LAMP é isotérmico, elimina a necessidade de termocicladores caros usados ​​em PCR, e é particularmente útil para o diagnóstico de doenças infecciosas em aplicações de campo. LAMP foi observado ser menos sensível que a PCR a inibidores em amostras complexas como sangue, vários relatórios descrevem a detecção bem-sucedida de patógenos de amostras minimamente processadas ou na presença de matrizes de amostras clínicas.

Informação adicional

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Aplicação

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